1、产品简介
安山生物单细胞转录组测序采用10X Genomics Chromium单细胞测序平台，该平台基于微流控芯片技术获得单细胞反应体系，基本过程为：首先将带有条形码和引物的凝胶珠和单个细胞包裹在油滴中；接下来在每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放 mRNA，通过逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA；液体油层破坏后，cDNA 进行后续文库构建，然后使用 Illumina 测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据，从而实现在单细胞水平进行表达测序的目的。
2、产品优势
- 高通量：一次可以同时运行8个样本，单个样本的细胞通量达1000-10000个；
- 高效率：十几分钟内可完成上万个细胞封装，一天内获得测序文库；
- 低成本：单个细胞成本远低于其他细胞平台；
- 应用广泛：10X Genomics是目前单细胞测序发文最多的平台
3、应用方向
1） 构建细胞图谱和发现新的细胞类型：单细胞转录组测序最直接的应用就是可在单细胞水平上重新定义细胞类型，从而可用于人体各组织器官细胞图谱的构建及发现新的细胞类型；
2） 肿瘤研究：单细胞转录组测序可用于肿瘤细胞异质性、肿瘤免疫微环境及肿瘤耐药性，肿瘤标志物等方向的研究；
3） 干细胞分化：单细胞转录组测序可用于鉴定干细胞分化过程中不同的细胞类型，绘制干细胞发育和分化轨迹，解析干细胞发育和分化的分子机理；
4） 胚胎和器官发育：单细胞转录组测序可用于胚胎发育和组织器官，包括于脑、肾脏、心脏、肺、小肠等发育的研究。
4、技术流程
5、技术参数
6、常见问题
Q1：单细胞测序平台有哪些？该如何选择？
答：目前常用的单细胞测序平台有三种：Fluidigm C1平台下的SMART-seq2，通量低，适用于少量和需要测转录组全长的样本；BD Rhapsody平台，通量高，细胞捕获率高，对细胞活性要求不高，10Xgenomics Chromium平台，通量高，成本低，操作简单；BD和10X都是当下单细胞测序的主流平台，但10X应用范围更广，支持发表的文章数更多。三者的优缺点和适用范围如下：
Q2：单细胞RNA测序方式有哪些？区别是什么？
答：根据建库方式的不同，10X Genomics单细胞测序又可分为3’RNA和5’RNA测序两种。在3’ RNA的建库中，凝胶珠末端的poly(dT)序列，和转录本3’端的polyA序列互补配对；而在5’ RNA的建库中，凝胶珠末端的TSO序列的polyG结构，和转录本的5‘端会添加的polyC结构发生互补配对。 3’RNA测序适用于含有polyA的RNA测序，包括真核生物的mRNA，lncRNA，以及有polyA的部分病毒的RNA，而不含有polyA的mRNA，如miRNA，circleRNA、原核生物的mRNA以及核糖体RNA，则不适用3’转录组测序；而5’转录组测序通常和免疫组库测序联合使用。
Q3：哪些样本适合单细胞核RNA测序？
答：并非所有的样本都适合单细胞RNA测序，对于那些长期冻存于-80℃冰箱或液氮中的珍贵临床样本，如肿瘤组织等；或者那些难以解离成单细胞的样本，如胰腺、肾脏组织等；亦或那些直径比较大，形态不规则的样本，如心肌细胞、脂肪细胞，神经细胞等，更适合提取细胞核，进行单细胞核RNA测序。
Q4：拿到单细胞转录组测序数据如何分析?
答：单细胞转录组测序分析基本思路：首先，可以根据各个细胞类群表达的标记基因进行细胞注释，探究是否存在新的细胞类型及其功能；其次，可以寻找不同处理组之间的差异基因，通过对差异基因进行功能注释，发现新的疾病标志物和疾病发生新机制；最后，可以对各亚群进行拟时序分化分析，分析亚群之间的分化关系以及分化过程中功能的变化。
安山生物单细胞转录组测序采用10X Genomics Chromium单细胞测序平台，该平台基于微流控芯片技术获得单细胞反应体系，基本过程为：首先将带有条形码和引物的凝胶珠和单个细胞包裹在油滴中；接下来在每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放 mRNA，通过逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA；液体油层破坏后，cDNA 进行后续文库构建，然后使用 Illumina 测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据，从而实现在单细胞水平进行表达测序的目的。
2、产品优势
- 高通量：一次可以同时运行8个样本，单个样本的细胞通量达1000-10000个；
- 高效率：十几分钟内可完成上万个细胞封装，一天内获得测序文库；
- 低成本：单个细胞成本远低于其他细胞平台；
- 应用广泛：10X Genomics是目前单细胞测序发文最多的平台
3、应用方向
1） 构建细胞图谱和发现新的细胞类型：单细胞转录组测序最直接的应用就是可在单细胞水平上重新定义细胞类型，从而可用于人体各组织器官细胞图谱的构建及发现新的细胞类型；
2） 肿瘤研究：单细胞转录组测序可用于肿瘤细胞异质性、肿瘤免疫微环境及肿瘤耐药性，肿瘤标志物等方向的研究；
3） 干细胞分化：单细胞转录组测序可用于鉴定干细胞分化过程中不同的细胞类型，绘制干细胞发育和分化轨迹，解析干细胞发育和分化的分子机理；
4） 胚胎和器官发育：单细胞转录组测序可用于胚胎发育和组织器官，包括于脑、肾脏、心脏、肺、小肠等发育的研究。
4、技术流程
5、技术参数
6、常见问题
Q1：单细胞测序平台有哪些？该如何选择？
答：目前常用的单细胞测序平台有三种：Fluidigm C1平台下的SMART-seq2，通量低，适用于少量和需要测转录组全长的样本；BD Rhapsody平台，通量高，细胞捕获率高，对细胞活性要求不高，10Xgenomics Chromium平台，通量高，成本低，操作简单；BD和10X都是当下单细胞测序的主流平台，但10X应用范围更广，支持发表的文章数更多。三者的优缺点和适用范围如下：
Q2：单细胞RNA测序方式有哪些？区别是什么？
答：根据建库方式的不同，10X Genomics单细胞测序又可分为3’RNA和5’RNA测序两种。在3’ RNA的建库中，凝胶珠末端的poly(dT)序列，和转录本3’端的polyA序列互补配对；而在5’ RNA的建库中，凝胶珠末端的TSO序列的polyG结构，和转录本的5‘端会添加的polyC结构发生互补配对。 3’RNA测序适用于含有polyA的RNA测序，包括真核生物的mRNA，lncRNA，以及有polyA的部分病毒的RNA，而不含有polyA的mRNA，如miRNA，circleRNA、原核生物的mRNA以及核糖体RNA，则不适用3’转录组测序；而5’转录组测序通常和免疫组库测序联合使用。
Q3：哪些样本适合单细胞核RNA测序？
答：并非所有的样本都适合单细胞RNA测序，对于那些长期冻存于-80℃冰箱或液氮中的珍贵临床样本，如肿瘤组织等；或者那些难以解离成单细胞的样本，如胰腺、肾脏组织等；亦或那些直径比较大，形态不规则的样本，如心肌细胞、脂肪细胞，神经细胞等，更适合提取细胞核，进行单细胞核RNA测序。
Q4：拿到单细胞转录组测序数据如何分析?
答：单细胞转录组测序分析基本思路：首先，可以根据各个细胞类群表达的标记基因进行细胞注释，探究是否存在新的细胞类型及其功能；其次，可以寻找不同处理组之间的差异基因，通过对差异基因进行功能注释，发现新的疾病标志物和疾病发生新机制；最后，可以对各亚群进行拟时序分化分析，分析亚群之间的分化关系以及分化过程中功能的变化。